牛布氏杆菌(BS)核酸检测试剂盒(PCR法)

操作步骤
1  病毒 RNA 的提取
1.1  取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 μL，充分颠倒混匀，室温静置 3～

5 min。

1.2  将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时 堵塞吸附柱），13000 rpm 离心 30 s。

1.3  弃去收集管中液体，加入 600 μL 洗液，13000 rpm 离心 30 s。

1.4 重复步骤 1.3。

1.5 弃去收集管中液体，13000 rpm 空柱离心 2 min，以除去残留的洗涤液。

1.6  将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 μL，室温静置 1 min，13000 rpm

离心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。

2  实时荧光 RT-PCR 操作
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，则反应体系配制如下： 试剂 体系



无菌无核酸酶水 2.7（N+1）μL

RT-PCR 反应液 10（N+1）μL

酶混合液 0.4（N+1）μL

荧光探针 1.9（N+1）μL



将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各 15 μL。

分别取 5 μL 模板 RNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光 PCR 仪上进行以下反应：

45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每个循环第二步（60℃ 35s）收集荧光信号，共

40 个循环。（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。

结果判定
1 结果分析条件设定 阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的点。不同仪器可根据仪器噪音

情况进行调整。
牛布氏杆菌(BS)核酸检测试剂盒(PCR法)2  结果描述及判定

阳性对照 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结果成 立；被检样品 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 AIV 阳性；被检样品 30＜Ct＜37 并出现特定的扩 增曲线，需重新取样提取 RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品 Ct 值≥37 时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样 品，应为阴性。

◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
   1）第一区：样本制备区。
 2）第二区：模板添加区。
   3）第三区：扩增及产物分析区。
   ★ 分区之间*进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

实验操作

1.模板制备（样本制备区）
建议使用配套水生动物病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。
2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）
剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-VH-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
3. 扩增反应（扩增及产物分析区）
使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。