上海沪峥生物科技有限公司
用于RNAi的慢病毒包装简要程序
更新时间:2020-03-18

以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×10∧6个293FT细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。轻柔混匀,室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293FT细胞。用含血清的DMEM培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293FT细胞(1×10∧6个细胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min,去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

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