细胞表面分子流式检测步骤说明注意事项

1． 在使用抗体之前，快速甩动一下，使之聚集到管的底部；

2． 荧光标记的抗体应该避光保存在4℃，不要冷冻；

3． 当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。

过程概述：

1． 制作外周血、淋巴组织或者培养细胞的单细胞悬液；

2． 细胞染色抗体（包括直接标记抗体和间接标记抗体）；

3． 洗涤步骤弃掉所有的为束缚的试剂

4． 运行分析流式仪。

注意：流式细胞染色实验中，所有实验条件的优化都很重要。关键参数包括靶细胞、抗体效价以及动力学。

试验A：小鼠淋巴细胞悬液的免疫荧光染色

材料：12×75 mm的圆底试管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圆底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗体（既未纯化也未偶联），

缓冲液： eBioscience流式染色缓冲液（Cat.No.00-4222），流式鞘液

仪器：移液管和移液器，离心机，冰柜或冰箱，流式仪

试验时间

半个小时细胞准备，半个小时抗体稀释和样品准备，半个小时到一个小时孵育过程，半个小时以上的运行和分析时间

方法细胞准备：

1． 采集组织（脾，淋巴结，胸腺），用注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；

2． 转移到50ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；

3． 4℃ 离心沉淀细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清；

4． 如果上过程采集的脾，还用用RBC裂解，否则进入下一步；

5． 用50ml染色液重悬样本，进行细胞计数和活力分析；

6． 再次离心细胞，弃掉上清，重悬细胞使其细胞数达到2×107 个/ml；