酶联免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以简单地回答样本中有多少蛋白质/多肽/抗体这一基本问题，是实验室比较常用的一种检测方法。而这种简单的分析方法的核心，就是标准曲线。没有它，我们的实验就变成了一个二元的“是/不是”测试。有了它，我们可以深入研究生物反应的细节。那么，是什么使得标准曲线如此强大呢?让我们在ELISA的背景来讨论这个问题。

简单地说，标准品就是一系列已知目标蛋白数量的阳性对照。例如，如果对人类IgG进行ELISA检测，标准曲线将包含逐渐减少的已知量的人类IgG，它会让你立刻得出一系列的结论。

1.我的ELISA实验有效吗?

是否可以看到标准品的信号？如果可以，实验是好的；如果没有，就应该进行故障排除。也许抗体问题，或者系统中的其他东西没有得到优化。

2.我的ELISA检测正常吗?

这是一个比较棘手的问题。当标准浓度下降时，信号是否减少？如果答案是肯定的，那
就是一个好的开始。如果答案是否定的，可能在某些步骤引入了一些背景，或者移液管
可能需要校准。

3.是否在系统中引入了背景?

一组适当的标准品总是以空白结束，在空白孔中不存在标准品。如果空白孔OD值为>0.1，说明可能引入了一些背景。

计算未知数

标准曲线的真正能量在于它能够测定未知样品的浓度。如果我们观察IgG反应，我们可以将样本的OD值与标准的OD值进行比较，并根据相对OD值得出一些结论。例如，如果我们知道一个333 ng/mL的标准品OD值在2.1左右，而一个111 ng/mL的标准OD值在1.7左右，那么我们可以假设一个未知的OD值在1.9左右应该在200 ng/mL左右。直到我们把它画在曲线上，然后得出一个方程。当我们检测到更多的目标时，OD值上升，当我们检测到更少的目标时，OD值下降。

那么，曲线一定是线性的吗？这看起来不太对。坦白地说，这和我们的眼睛告诉我们的并不相符。如果我们有1200ng /mL的浓度，OD值会是3吗?当然不是。数据看起来接近一条水平渐近线——曲线不会通过这个值。所以不管浓度有多高，都不会超过2.5左右。类似地，这条曲线似乎表明，如果浓度为负，可以生成OD值在0.5左右。

4.参数对数曲线

使用图1的数据来拟合，得到如下s曲线。这条曲线非常清楚地显示了水平渐近线，同时也显示了标准浓度增加或减少时的良好的、与剂量相关的响应。

四参数方程的拟合函数表达式为：

在这个方程中，“a”和“d”分别表示可以得到的最小值和最大值——我们的渐近线。“c”表示拐点——曲线的中点，“b”表示曲线在“c”处的斜率。根据这个方程，我们现在可以反算出一个样本的未知浓度。大多数ELISA阅读器都可以自动完成这项工作。

它不仅限于竞争法, 夹心法也可以用它。它的形状, 根据情况, 可能是一个单调上升的类似指数, 对数, 或双曲线的曲线, 也可能是一个单调下降的上述曲线, 还可以是一条 S 形曲线。 它要求 X 值不能小于 0 (因为指数是实数, 故有此要求)。 在很多情况下它都可以拟合 ELISA 的反应曲线, 所以它也成了 ELISA 中应用最广的模型之一。

当使用4参数拟合曲线时，记住一些实用的技巧是有帮助的。由于以渐近线开始和结束，曲线范围之外的数据可能会产生不准确的结果。更进一步说，试着在S中间标准曲线的线性范围内工作。一般来说，未知计算在曲线的线性范围内更准确。可以稀释超出标准曲线范围的样本，根据标准曲线计算浓度，然后根据初始稀释值乘以相应倍数。