1、细胞冻存前12~24h，换新鲜培养基，使细胞一直处于对数生长期。

　　2、待细胞长至80%汇合时胰酶消化，用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液，1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。

　　3、弃上清，加入冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内，每管1~1.5mL，拧紧盖子。在管壁上做好标记，标明细胞名称、冻存日期等。（细胞冻存液配方可为胎牛血清：培养基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培养基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根据各实验室实际条件调整）

　　4、按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜，再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要跟换一次，以免影响冻存效果。

　　5、细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。